Вестернблоты - Иммуноблоты                          

 

Непрямая иммунофлюоресцентная микроскопия

Непрямая иммунофлюоресцентная микроскопия – это классический метод, применяемый для определения аутоантител в сыворотке крови. Возможно одновременное определение широкого спектра аутоантител, имеющих важное диагностическое значение в ревматологии, дерматологии, гастроэнтерологии и других клинических дисциплинах.

Несмотря на необходимость определенной подготовки оператора, проводящего исследование и интерпретацию результатов, непрямая иммунофлюоресцентная микроскопия остается быстрым, простым и легко воспроизводимым методом диагностики, являясь наиболее дешевым и доступным методом для рядовых клинических лабораторий. Техника проведения непрямой иммунофлюоресцентной микроскопии включает в себя инкубацию различных разведений проб на культуре ткани. Культуру тканей получают методом ультратонких срезов замороженных тканей различных органов грызунов и приматов. Во время проведения инкубации пробы на культуре ткани аутоантитела, содержащиеся в пробе, связываются с соответствующими антигенами культуры ткани (рис. 1). После тщательной промывки для удаления несвязавшихся аутоантител на культуру ткани наносится меченный флюоресцеином анти-глобулиновый коньюгат и проводится вторая инкубация (рис. 2). Этот этап также заканчивается тщательной промывкой. Затем на культуру ткани наносится глицерин и покровное стекло. Препарат готов для микроскопии на флюоресцентном микроскопе (рис. 3).

Рис. 1, 2, 3

Проба считается положительной при наличии флюоресценции определенного вида, интенсивность которой выражается количественно как степень разведения пробы. Существуют определенные международные стандарты, когда используются международные единицы (как, например, стандарт ВОЗ по анти-ядерным антителам).

Клиническое применение

 

Препараты тканей грызунов

 

Метод непрямой иммунофлюоресценции является методом скрининга для выявления анти-ядерных аутоантител. Анти-ядерные аутоантитела IgG класса выявляются при наличии различных заболеваний соединительных тканей, а также многих других аутоиммунных заболеваний. Так уровень анти-ядерных аутоантител выше 3 М.Е./мл отмечается при ревматоидном артрите, синдроме Съегрена, системной красной волчанке, смешанных заболеваниях соединительной ткани, склеродермии и системном склерозе. Препаратами выбора обычно является печень крысы или мыши, имеющие одинаковую чувствительность. По виду иммунофлюоресценции на препарате можно определить вид аутоантител и, соответственно, нозологическую единицу – заболевание. Так при наличии гомогенного окрашивания ядра можно думать о наличии системной красной волчанки или лекарственной волчанке (Рис. 4), при наличии зернистого окрашивания ядра – о синдроме Съегрена или смешанной болезни соединительной ткани, при наличии нуклеолярного типа окрашивания ядра – о склеродермии или системном склерозе. Перинуклеарное окрашивание может выявляться при ревматоидном артрите. Аутоантитела имеют достаточно большой период полураспада, поэтому проведение теста более часто, чем 1 раз в месяц нецелесообразно (исключением является тестирование после проведения процедуры плазмафереза).

Рис. 4

Альтернативным субстратом ткани для выявления антиядерных аутоантител при проведения непрямой иммунофлюоресцентной микроскопии являются HЕp-2 клетки (Human Epithelioma Cells). Данные клетки имеют очень большое ядро, что позволяет значительно проще оценивать вид иммунофлюоресцентного окрашивания клетки. Однако данный препарат более дорогой и требует более квалифицированной интерпретации результатов микроскопии.

Аутоантититела к париетальных клетках желудка определяются на ткани желудка грызунов (Рис. 5). Возможно использование ткани желудка крысы и мыши, однако ткань желудка мыши предпочтительнее, так как имеет меньшую тенденцию к взаимодействию с гетерофильными антителами. Данный тест является высоко чувствительным на ранних стадиях пернициозной анемии. Определение внутреннего фактора (Intrinsic factor) может использоваться как подтверждающий тест.

Рис. 5

 Анти-митохондриальный антитела (AMA) обычно выявляются на препаратах почек грызунов (крысы или мыши) (Рис. 6).

Рис. 6.

Зернистое окрашивание цитоплазмы может также отмечаться на препаратах печени. Выявление данных аутоантител очень важно для диагностики аутоиммунных заболеваний печени и, прежде всего, первичного билиарного цирроза печени. Анти-митохондриальные аутоантитела выявляются за много лет до клинических проявлений заболевания. Метод имеет 95% специфичность для выявления первичного билиарного цирроза печени, при этом антигеном является комплекс пируват-дегидрогеназы. Проведение иммуноферментного анализа на выявление аутоантител к М2 (митохондриальному) антигену является подтверждающим тестом. Другие анти-митохондриальные аутоантитела также могут выявляться при непрямой иммунофлюоресцентной микроскопии. Клиническая значимость данных аутоантител представлена в следующей таблице 1.

 Таблица 1. Митохондриальные антитела

 Митохондриальные аутоантитела

Клиническое значение

М1

Сифилис

М2

Первичный билиарный цирроз печени

М3

Люпус-подобные заболевания

М5

Заболевания соединительной ткани

М6

Медикаментозный гепатит

М7

Миокардиты и миокардиопатии

При 4 типе гепатита или хроническом активном гепатите у 40% пациентов отмечается наличие антител к гладкой мускулатуре в разведении выше 1:40. Наличие данных аутоантител практически исключает наличие системной красной волчанки (СКВ). Антитела к гладкой мускулатуре встречаются также у больных с меланомой и раком яичников. При наличии данных аутоантител отмечается флюоресцентное свечение мышечного слоя слизистой желудка на препаратах грызунов (F-актиновые нити). Отмечается также флюоресцентное свечение кровеносных сосудов на препаратах печени и почек грызунов (рис. 7).

Рис. 7.

LKM антитела (Liver-Kidney-Microsomal antibodies) связываются с антигеном цитохром P450 как в гепатоцитах (препарат печени грызунов) - рис. 8, так и в проксимальных почечных канальцах (препарат почек грызунов) - рис. 9.

Выделяют 3 типа LKM антител.

bullet

1 тип LKM антител сочетается с наличием у пациентов 2a и 2b типов аутоиммунного хронического активного гепатита.

bullet

2 тип LKM антител обычно сочетается с наличием у пациента медикаментозного гепатита.

bullet

3 тип LKM антител обычно сочетается с наличием у пациента гепатита, вызванного вирусом дельта - δ-гепатит.

 Рис. 8

Рис. 9

Кератиновые антитела (KAB) определяются в кератиновой оболочке слизистой пищевода на препарате пищевода крыс. (Рис. 10). Эти антитела являются наиболее специфичными из известных аутоантител, встречающихся при ревматоидном артрите. Кератиновые антитела появляются на ранних стадиях заболевания, что позволяет начать своевременное лечение (базовую терапию) для предотвращения развития деструкции суставов.

 Рис. 10

Описанные выше тесты проводятся на препаратах, изготовленных из тканей грызунов, что обуславливает их относительно низкую стоимость. Эффективность затрат на проведение тестов может быть повышена при использовании в качестве препаратов нескольких тканей на одном смотровом полей. Так комбинированные препараты, производимые компанией Immunotec позволяют тестировать сыворотку пациенту одновременно на наличие антиядерных антител, антимитохондриальных антител, антител к гладкомышечной мускулатуре, антикератиновых антител, антител к париетальным клеткам желудка и анти-LKM антител.

 

Препараты тканей приматов

Антигены приматов и человека показывают высокую степень гетерогенности. Поэтому ткани приматов являются очень полезными субстратами для определения как органоспецифических так и органонеспецифических аутоантител.

Ниже приведены ряд примеров использования определенных тканей приматов для диагностики определенных заболеваний.

Так иммунофлюоресцентное тестирование на препарате пищевода обезьяны является основным методом выявления антител IgA класса к эндомизию при диагностике целиакии - глютеновой непереносимости. Данный медом обладает 100% чувствительностью и относительно высокой специфичностью, что делает его идеальным для первичного скрининга по выявлению данного заболевания. В дополнение, данный тест может быть положительным у 60-70% больных с герпетиформным дерматитом. Антитела пробы сыворотки связываются с ретикулиновым компонентом эндомизия гладкой мускулатуры пищевода (Рис. 11). Этот тест имеет очень важное значение в педиатрии, так как позволяет избежать проведения инвазивных исследований (биопсия слизистой тонкого кишечника).

Рис. 11

Препарат пищевода приматов также используется для диагностики таких дерматологических заболеваний как буллезный пемфигоид (буллезная пузырчатка) и пемфигус (пузырчатка). При буллезной пузырчатке отмечается наличие зудящих волдырей на туловище и конечностях. Антитела IgG класса локализуются в области дермо-эридермального соединения (Рис. 12). При вульгарной пузырчатке отмечается сотовый патерн иммунофлюоресценциии (Рис. 13). Изменение титра антител позволяет следить за эффективностью лечения и прогнозировать исход заболевания.

Рис. 12 Рис. 13

Для диагностики инсулин-зависимого диабета 1 типа используются препараты островковых клеток поджелудочной железы приматов (Рис. 14), для диагностики синдрома Гудпасчера (наличие аутоантител к базальной мембране клубочков) - препараты почек приматов (Рис. 15), для диагностики болезни Аддисона - препараты надпочечников приматов (Рис. 16), для диагностики синдрома Дресслера - препараты сердечной мышцы приматов (Рис. 17), для диагностики первичной яичниковой недостаточности аутоиммунной природы - препараты яичников приматов

 

Рис. 14

Рис. 15

Рис. 16

Рис. 17

Таблица 2. Продукция Immunotec

Product

Product Code

Monkey Oesophagus 10  well slide

APO10

Monkey Oesophagus 5  well slide

APO5

Rat Liver Kidney Stomach 10 well slide

RLKS10

Rat Liver Kidney Stomach 5 well slide

RLKS5

Mouse Liver Kidney Stomach 10 well slide

MLKS10

Mouse Liver Kidney Stomach 10 well slide

MLKS10

Rat Liver Kidney 10 well slide

RLK10

Monkey Pancreas 4 well slide

PP4

FeedBack
E-mail: postmaster@westernblot.ru