Вестернблоты - Иммуноблоты                         

 

Вестернблот Borrelia burgdorferi

 

Вестернблот для определения IgG/IgM антител против различных антигенов Borrelia Burgdorferi

(антиген: Borrelia Burgdorferi) 

Краткое изложение и объяснение теста

Болезнь Лайма названа по имени города Лайм в штате Коннектикут в США, где она впервые была диагностирована в 1975 году. Передача заболевания происходит при укусе инфицированными клещами (в США - lxodes damminii, в Европе - lxodes ricinus). Таким образом болезнь является эндемической в тех регионах, где встречаются данные клещи (Северная и Средняя Европа, также некоторые части южной Европы, США, Канада, Япония). В этих областях от 2 до 20 % клещей инфицированы Borrelia burgdorferi, бактерией, вызывающей болезнь Лайма, относящейся к роду Спирохет и впервые открыто Вили Бургдорфером в 1982 году.

При развитии болезни Лайма (боррелиоза), Borrelia Burgdorferi, как и возбудитель сифилиса Treponema pallidum, вызывает 3 различные стадии заболевания:

  1. Ранняя стадия хроническая мигрирующая эритема (Erythema chronicum migrans - ECM) – изменяющее покраснение кожи в области укуса клеща
  2. Генерализация инфекции с развитием лимфоцитомы, кардита, лимфоцитарного менингорадикулита (мультисистемное заболевание с поражение кожи, сердца, нервной системы и т.д.)
  3. Поздняя стадия заболевания артриты, хронический атрофический акродерматит (Acrodermatitis chronica atrophicans - ACA), прогрессирующий энцефаломиелит (нейроборрелиоз) – хроническое заболевание с поражение кожи, синовиальных оболочек и мозга.

Постановка диагноза болезни Лайма довольна сложна, потому что симптомы, описанные выше обычно встречаются по одному, редко два и очень редко три. Например, хроническая мигрирующая эритема  встречается максимум в 50 % всех случаев. Посев Borrelia Burgdorferi на культуральной среде затруднителен и требует много времени, поэтому серологические исследования являются единственным лабораторным тестом для постановки и подтверждения диагноза болезни Лайма (боррелиоза).

Преобладание значительно возросших титров антител зависит от стадии заболевания и ее продолжительности.

Так в I стадии заболевания (ранняя фаза) повышение титра антител отмечается только у 20 – 50 % всех случаев заболевания (в основном IgM).

Во II стадии заболевания (генерализация инфекции) повышение титра антител отмечается у 70 – 90 % всех случаев (IgG и IgM).

И только в III стадии заболевания повышение титра антител отмечается, за редким исключением, практически у всех пациентов.

Персистирующий титр IgM-антител, неспецифические реакции и различные вариации результатов зависят от методов определения антител и используемых антигенов, что делает интерпретацию результатов крайне затруднительной. Поэтому диагноз болезни Лайма (боррелиоза) должен подтверждаться более чем одним тестом. Поэтому все пограничные и слабо положительные результаты должны подтверждаться методом вестрнблота (рекомендации Центра по контролю за болезнями, Атланта, США - Center of Disease Control -  СDC in Atlanta, USA).

При проведение иммуноферментного анализа происходит определение общего количества антител (специфических и неспецифических) против всех антигенов Borrelia Burgdorferi (специфических и неспецифических). Тест на выявление антител может быть положительным за счет наличия антител против неспецифических антигенов.

Методика вестернблота является высокоспецифичной. Она позволяет определять наличие специфических антител против различных Borrelia Burgdorferi специфических антигенов, при этом можно исключить влияние перекрестных реакций на различные неспецифические антигены Borrelia Burgdorferi.

Литература

  1. Benach, J.L., Bosler, E.M., Burgdorfer, W., Hanrahan, J.P., Colemann, J.L. et al. Spirochetes isolated from the blood of two patients with Lyme disease. New England J. of Med. 1983; 308: 740.
  2. Bergström, S., Sjöstedt, A., Dotevall, L., Kaijser, B., Ekstrand, B., Wallberg, C., et al. Diagnosis of Lyme Borreliosis by an enzyme immunoassay detecting immunglobulin G reactive to purified Borrelia burgdorferi cell components. Eur. J. Clin. Mikrobiol. Infect. Dis. 1991; 5: 422-427.
  3. BGA Merkblatt Nr. 56 Bundesgesundheitsblatt 4/91 Lyme-Borreliose - Erkennung und  Verhütung.
  4. Burgdorfer, W. und Barbour, A. C. Lyme disease - a tick-borne spirochetosis? Science 1982; 216: 312.
  5. Barbour, A. G., Heiland, R. A., Howe, T. R. Heterogenity of major proteins in Lyme disease Borreliae: a molecular analysis of North American and European isolates. J. Infect. Dis. 1985; 152: 478-484.
  6. Blenk, H. Serodiagnostik der Lyme-Borreliose. mta 1993; 8: 575-580. Craft, J. E., Fisher, D. K.,  Shimato G. T., Steere, A. C. Antigens of Borrelia burgdorferi recognized during Lyme disease. J. Clin. Invest. 1988; 78: 934-993.
  7. Magnarelli, L. A., und Anderson, J. F. Early detection and persistence of antibodies to Borrelia burgdorferi in persons with Lyme disease. Zbl. Bakt. Hyg. 1986; A 263; 392.
  8. Magnarelli, L. A., Miller, J. N., Anderson, J. F., Riviere, G. R. Cross-reactivity of nonspecific  treponemal antibody in serologic tests for Lyme disease. J. Clin. Mikrobiol. 1990; 6: 1276-1279.
  9. Putzker, M., Mertes, T., Sobe, D. Beeinflussung der serologischen Diagnostik von Infektionen mit Borrelia burgdorferi durch Kreuzreaktionen. Doppelinfektionen mit FSME-Virus. Lab. med. 1991; 15: 223-227.
  10. Putzker, M., Schmell, K. W., Sauer, H. Die Lyme-Borreliose - eine klinisch und labordiagnostisch schwer faßbare Multisystemerkrankung. GIT Labormedizin 1991; 11: 461-469.
  11. Raoult, D., Hechemy; K. E., Baranton, G. Cross-reaction with Borrelia burgdorferi antigen of sera from patients with HIV-infection, Syphilis, and Leptospirosis. J. Clin. Mikrobiol. 1989; 10: 2152-2155.
  12. Schmidt-Wolf, J. und Sticht-Groh, V. Zur Lyme-Krankheit. Humorale Antikörperbestimmung gegen Borrelia burgdorferi in drei verschiedenen Patientengruppen. Ärztl. Lab. 1989; 35: 153.
  13. Wilske, B. Serodiagnostik der Lyme-Borreliose. Z. Hautkr. 1988; 63: 511.
  14. Wilske, B., Preac-Mursic, V., Fuchs, R., Schierz, G. Diagnostik der Lyme-Borreliose. Diagnose und Labor 1990; 1: 24-36.
  15. Zöller, L., Haude, M., Sonntag, H.-G. Validität der Standardverfahren in der Serodiagnostik der Lyme-Borreliose und Einfluß methodischer Varianten. Lab. med. 1990; 14: 404-411.

Вестернблот для определения IgG и IgM антител против различных антигенов Borrelia Burgdorferi

Анализ получаемых на тестовой мембране полосок и интерпретация результатов

Пороговый уровень - Стандарт: IgM/IgA - 10 %, IgG - 20 %

С помощью данного Вестерблота в сыворотке крови могут быть идентифицированы соответствующие антитела к следующим антигенам:

93 kDбелок из мембранных везикул наружной поверхности Borrelia Burgdorferi. Иммунный ответ против данного белка высоко специфичен. В большинстве случаев можно регистрировать наличие только IgG антител против данного антигена. Антиген p93 является типичным маркером поздней или хронической фазы заболевания. Данные антитела очень часто определяются в сыворотке пациентов, страдающих артритом при болезни Лайма. В некоторых случаях в острой стадии болезни Лайма определяются IgM антитела против антигена p93. В данной ситуации можно предположить о большой вероятности перехода болезни Лайма в хроническое течение.

62-72 kDтепловой шоковый протеин. Эти белки являются неспецифичными для Borrelia Burgdorferi, отмечается перекрестная реакция ко множеству других бактерий. Однако выявление антител к данным антигенам 62 kD и 72 kD имеет диагностическое значение, когда одновременно имеются антитела к антигену p93. Это является подтверждением хронической стадии заболевания. Заключение: наличие широких полосок на мембране вестернблота между 60 и 93 kD является весомым подтверждением диагноза болезни Лайма, хроническая стадия с вытекающей необходимостью проведения специфической терапии.

60 kDобщий антиген. Неспецифический антиген. Отмечается высокая частота перекрестных реакций с другими бактериями.

48 kD – данные о специфичности данного антигена противоречивы, однако выявление антител к данному антигену поддерживает диагноз боррелиоза.

41 kDбелок флагеллин. Является неспецифическим для Borrelia Burgdorferi. Доказана высокая частота перекрестных реакций на множество бактерий. Несмотря на это, является очень важным и полезным маркером, потому что антитела к данному антигену выявляются в очень ранней стадии заболевания. Например, в ранней стадии болезни Лайма во многих случаях отмечается наличие только IgM антител против антигена p41 и высокоспецифичного антигена Osp C белка, что позволяет диагностировать раннюю стадию болезни Лайма. Однако, если другие специфические антитела не определяются, данная находка может быть затруднена в интерпретации, особенно при анализе IgG вестренблота.

39 kDбелок p39. Высоко специфичный антиген для Borrelia. Маркер ранней стадии инфицирования. К данному антигену могут выявляться IgM антитела. Если имеется выраженная реакция против антигена Флагеллина, бывает довольно трудно дифференцировать на мембране блота полоску на уровне 39 kD от полоски на уровне 41 kD.

37 kD – специфичность не очень выражена, однако выявление антител к данному антигену поддерживает диагноз болезни Лайма

34 kD OspB (белок B наружной поверхности). Высоко специфичен для Borrelia Burgdorferi.

31 kD OspA (белок A наружной поверхности). Высоко специфичен для Borrelia Burgdorferi. В ряде популяции имеется выраженная экспрессия данного антигена и, соответственно, перекрестная и неспецифические реакции. В этих случаях данный антиген не является высокоспецифичным маркером.

30 kDВысоко специфичный для Borrelia Burgdorferi антиген. Функция не установлена.

29 kD OspD (белок D наружной поверхности). Высоко специфичен для Borrelia Burgdorferi. Чаще выявляются IgM антитела, чем IgG антитела, поэтому является хорошим маркером острой фазы болезни Лайма.

21 kD – вероятно принадлежит OspC комплексу. Высоко специфичен для Borrelia Burgdorfer. Маркер ранней стадии болезни Лайма.

18 kD – данные о специфичности данного антигена противоречивы. При выявлении антител только к данному антигену, диагноз болезни лайма не правомочен.

Дополнительная помощь в интерпретации (от производителя)

IgG антитела могут выявляться против всех упомянутых выше антигенов. Для положительной интерпретации теста необходимо выявление на мембране блота как минимум 2 полосок (антигенов), трактуемых как специфические, и 2 других неспецифических полосок.

Выявление 1 специфической полоски на мембране блота недостаточно для положительной интерпретации теста, однако при наличии на мембране блота также 4 неспецифических полосок вероятность положительного заключения делается высоко вероятной. При наличии на мембране блота широкого спектра полосок выше 60 kD вместе с одной специфической полоской свидетельствует о диагнозе поздней стадии хронического баррелиоза (Болезнь Лайма, хроническая стадия, поздняя стадия).

IgG положительный тест:

наличие 2 высокоспецифичных полосок и 2 неспецифичных полосок

наличие 1 высокоспецифичной полоски и 4 неспецифичных полосок

IgG пограничный тест:

наличие 2 высокоспецифичных полосок и 1 - 2 неспецифичных полосок

наличие 1 высокоспецифичной полоски и 2 - 3 неспецифичных полосок

отсутствие высокоспецифичных полосок и наличие 5 неспецифичных полосок

CDC критерии (не подтвержденные для данного теста):

Положительный тест - наличие на мембране блота 5 из следующих полосок:

21, 25, 28, 30, 39, 41, 48, 60, 62, 93 kD

Сомнительный тест - наличие на мембране блота менее 2 вышеперечисленных полосок

IgM антитела в основном направлены против следующих антигенов Borrelia Burgdorferi:

18, 21, 25, 31, 34, 39, 41 kD

Выявление 2 из вышеперечисленных полосок на мембране блота свидетельствует об активной стадии болезни Лайма (острая стадия).

Выявление IgM антител только против 1 из антигенов Borrelia Burgdorferi 21 kD или 25 kD также свидетельствует об активной стадии болезни Лайма (острая стадия).

IgM положительный тест:

наличие 1 полоски (21 kD или 25 kD)

наличие 1 полоски 41 kD  и одной из следующих полосок 18, 21, 25, 28, 29, 30, 31, 34, 37, 39, 48, 93 kD

наличие 2 или более высокоспецифичных полосок

IgM пограничный тест:

наличие 1 полоски 41 kD

наличие 1 из следующих полосок 28, 30, 34, 39, 93 kD

CDC критерии (не подтвержденные для данного теста):

Положительный тест - наличие на мембране блота 2 из следующих полосок:

21, 25, 28, 37, 41, 48, 60, 93 kD

Сомнительный тест - наличие на мембране блота менее 2 вышеперечисленных полосок.

Ограниченности метода

bullet

Результаты теста должны трактоваться в контексте общей клинической картины и других лабораторных данных.

bullet

Наличие у пациента инфицирования вирусом Эбштейн-Барр может вызывать поликлональную стимуляцию B-клеток с повышением титра антител против Borrelia Burgdorferi при отсутствии активного заболевания. Поэтому при наличии положительного результата теста вестернблот Borrelia Burgdorferi и отсутствии клинических признаков заболевания необходимо исключить наличие инфекции вирусом Эбштейн-Барр.

bullet

Сыворотка пациентов, инфицированных другими видами спирохет (включая Treponema pallidum – сифилис) или страдающих аутоиммунными заболеваниями (включая ревматоидный артрит), может содержать антитела, имеющие перекрестную реакцию на некоторые антигены  Borrelia Burgdorferi. В данной ситуации интерпретация теста, приведенная выше, должна проводиться с определенными ограничениями.

bullet

Отрицательный результат теста не исключает возможности недавно перенесенной инфекции. Если у больного имеются клинические признаки заболевания, рекомендуется проведение теста на выявление IgM-антител. Если оба теста отрицательные, рекомендуется повторить тест через 10 – 14 дней для исключения замедленного иммунного ответа с выработкой антител.

 

Обратная связь

E-mail: postmaster@westernblot.ru

Вы можете сделать данные тесты www.fides-lab.ru

Тел: 8 (495) 401 05 77

Москва, Алтуфьевское шоссе 9 (Метро Владыкино)