Вестернблоты - Иммуноблоты                         

 

Вестернблот Ebstein-Barr Virus

 

Вестернблот для определения IgG/IgM/IgA антител против различных антигенов вируса Эбштейн-Барр

 Краткое изложение и объяснение теста

Вирус Эбштейн-Барр входит в семейство Herpes вирусов.

Морфологически вирусы этого семейства очень похожи, однако имеют значительные антигенные отличия между собой.

Вирус Epstein-Barr  является причиной заболевания инфекционного мононуклеоза.

Заболевание инфекционным мононуклеозом может протекать с большими вариациями от асимптоматического течения, наиболее часто отмечающегося в раннем детстве, до клинически выраженного заболевания, наиболее часто встречающегося в молодом возрасте.

Передача вируса в основном осуществляется через слюну (болезнь поцелуя), при этом в начале происходит инфицирование эпителия носоглотки. Отсюда происходит инфицирование B-лимфоцитов, которые трансформируются в крайне пролиферированные лимфобласты. Они формируют типичные мононуклеарные клетки, легко определяемые при анализе клеточного состава периферической крови. Однако, подобная  пролиферация лейкоцитов типична не только для инфекционного мононуклеоза. Она также имеет место при лейкемии, цитомегаловирусной инфекции и др. Инфекционный мононуклеоз должен четко дифференцироваться от этих заболеваний.

Так как изоляция вируса очень сложна и требует времени, для обнаружения вируса  Epstein-Barr широко используются серологические методы исследования крови, которые считаются лучшим методом идентификации вируса Epstein-Barr.

Метод Paul-Bunnel для обнаружения гетерофильных антител с успехом используется у взрослых (хотя могут отмечаться ложно-положительные результаты), однако у детей данный метод не пригоден, так как до 50 % случаев пропускает первичную инфекцию.

В связи с этим были разработаны системы для определения антиген-специфических антител против вируса Epstein-Barr. Вначале для скрининга применяли определение антител к вирусному капсидному антигену. Однако наличие данных антител IgG класса свидетельствует только о перенесенном заболевании. Антитела к вирусному капсидному антигену IgM класса могут отсутствовать при первичной инфекции и отсутствуют в большинстве случаев реактивации инфекции.

Реактивация инфекции может иметь место, потому что вирус Epstein-Barr сохраняется в B-лимфоцитах в течение всей жизни. Реактивация инфекции вирусом Epstein-Barr не встречается так часто как при инфицировании цитомегаловирусом, но является серьезной проблемой у пациентов с иммунодефицитом. В этих случаях реактивация инфекции вирусом Epstein-Barr  должна дифференцироваться от первичного инфицирования вирусом Epstein-Barr. 

Наилучшим маркером активности заболевания являются антитела против раннего антигена (Early Antigen - EA). Наибольшее  значение имеет определение  диффузного (diffuse) раннего антигена -EA-D (diffuse) – так как антитела к ограниченному  (restricted) раннему антигену -EA-R (restricted) определяются только у детей раннего возраста. Антитела против раннего антигена (EA) присутствуют практически во всех случаях активной инфекции, однако дифференцировать первичную инфекцию и реактивацию инфекции по наличию данных антител не представляется возможным.

 Для дифференциации первичной инфекции вирусом Epstein-Barr и реактивации инфекции вируса Epstein-Barr используют выявление антител против Эбштейн-Барр ядерного антигена 1 (Ebstein-Barr Nuclear Antigen 1- EBNA-1). Антитела против ядерного антигена 1 (EBNA-1) появляются как минимум только через 8 – 10 недель от начала заболевания  и сохраняются в течение всей жизни. Исходя из этого при, первичной активной инфекции вирусом Epstein-Barr антитела против ядерного антигена 1 (EBNA-1) должны отсутствовать, а при реактивации инфекции вируса Epstein-Barr антитела против ядерного антигена 1 (EBNA-1) должны быть положительны.

В заключение следует отметить, что для постановки правильного диагноза вирусной инфекции Epstein-Barr с учетом стадии и активности процесса необходимо поставить 4  (четыре !!!) различных ELISA теста. Данная система Вестернблота позволяет определять наличие всех 4 вышеописанных антител с высокой чувствительностью и специфичностью.

Проведение данного теста особенно важно для пациентов, страдающих синдромом врожденного или приобретенного иммунодефицита, онкологических пациентов, получающих химиотерапевтическое лечение или радиотерапию, а также пациентов после трансплантации органов и тканей.

Литература

  1. Sumaya, C.V. Serological testing for Epstein Barr Virus - Developemens in interpretation. J. infect. dis. 151, 984-987 (1985)
  2. Henle, W., Henle, G., Lannette, E.T. Epstein Barr Virus. Scientific American, 241, 40-52, (1979)
  3. Lannette, E.T. Epstein Barr Virus.In Manual of clinical Microbiology, 5 th ed. Eds.: Balows, A., Hausler, Jr., W.J., Hermann, K.L., Isenberg, H.D., Shadomy, H.J. pp 847-852, ASM, Washington D.C. (1991)
  4. Schillinger, M., Kampmann, M., Henninger, K., Murray, G., Hanselmann, I., Bauer, G. Variability of humoral immune response to acute Epstein Barr Virus (EBV) infection: Evaluation of the significance of serological markers. Med. Microbiol. Lett. 2, 296-303, (1993)

Вестернблот для определения IgG/IgM/IgA антител против различных антигенов вируса Эбштейн-Барр

Анализ получаемых на тестовой мембране полосок и интерпретация результатов

Пороговый уровень - Стандарт: IgM - 10 %, IgG - 20 %

С помощью данного Вестерблота в сыворотке крови могут быть идентифицированы соответствующие антитела к следующим антигенам:

bullet

Мембранный антиген (Membrane-antigen - MA)

Роль данных антител против мембранного антигена еще не выяснена. Они появляются на ранней стадии заболевания, однако редко присутствуют через 6 месяцев от начала заболевания.

bullet

Вирусный капсидный антиген (Virus-capsid-antigen - VCA)

Наличие антител к вирусному капсидному антигену (VCA-IgG) является классическим маркером перенесенной инфекции вирусом Эбштейн-Барр. Антитела против VCA появляются довольно рано от начала заболевания, сохраняются в течение всей жизни и свидетельствуют о перенесенной инфекции. По наличию антител тел к вирусному капсидному антигену невозможно дифференцировать первичную острую инфекцию и реактивацию инфекции. На нитроцеллюлозной мембране может определяться до 7 различных полосок, связанных с различными подтипами вирусного капсидного антигена. Высокомолекулярные подтипы вирусного капсидного антигена (интактные белки) часто проявляются в виде очень слабо окрашенных полосок, так как антигенные детерминанты этих высокомолекулярных белков теряются при электрофорезе. В связи с этим стрипы  блота должны очень тщательно просматриваться в высокомолекулярной зоне, чтобы не пропустить этих слабоокрашенных полосок. Низкомолекулярные  подтипы VCA  проявляются более четко, однако в ряде случаев могут полностью отсутствовать. Проба считается положительной на наличие антител к VCA даже при наличии одной из семи полосок на стрипе. VCA-IgM является маркером свежей инфекции (от 1 до 3 недель) и редко выявляется при реактивации инфекцию

bullet

Диффузный ранний антиген - Early-antigen diffuse (EA-D)

bullet

Ограниченный ранний антиген -  Early-antigen restricted (EA-R)

EA-IgG-полоска проявляется при наличии активной инфекции, как при острой первичной инфекции, так и при реактивации инфекции, независимо от того определяется VCA или нет. Полоска становиться менее выраженной, когда активность инфекционного процесса ослабевает, и практически исчезает при отсутствии активной инфекции у здоровых лиц, перенесших ранее инфекцию вируса Эбштейн-Барр. Проявление лишь одной из двух полосок раннего антигена (EA-полоска - R или D) достаточно для подтверждения активности инфекционного процесса. В большинстве случаев проявляется лишь EA-D полоска. Эта полоска проявляется раньше других при острой первичной инфекции (через 3 – 6 недель от начала заболевания), обычно имеет большую ширину, сильно окрашена в середине и имеет размытые края. В то же время при реактивации инфекции EA-D полоска проявляется более ясно и отчетливо и имеет с ограниченные края. EA-R обычно появляется через 3 – 6 месяцев от начала заболевания. Одновременное проявление EA-полоски и EBNA-1-полоски практически всегда свидетельствует о реактивации процесса. Только в редких случаях EA-полоска сохраняется в течение длительного времени после угасания инфекционного процесса, однако, в этом случае это всегда EA-антитела IgG класса. ЕА-антитела IgM класса не определяются. Таким образом, при отсутствии клинических данных за активный инфекционный процесс и одновременном проявлении на блоте EBNA-1 полоски и EA-полоски, необходимо повторить тест с IgM-вестернблотом (EBV-IgM-WesternBlot). Отрицательный результат данного теста (отсутствие на мембране блота EBNA-1 полоски и EA-полоски) исключает активный инфекционный процесс.

bullet

Специфический ядерный антиген вируса Эбштейн-Барр - Epstein-Barr-Virus Specific Nuclear Antigen (EBNA)

Существует как минимум 6 различных специфических ядерных антигенов вируса Эбштейн-Барр, однако иммунологический ответ хорошо описан лишь к EBNA-1 и к EBNA-2. Касательно роли иммунного ответа к другим специфическим ядерным антигенам вируса Эбштейн-Барр детальная информация в литературе отсутствует.

Антитела к специфическим ядерным антигенам вируса Эбштейн-Барр 1 подтипа (EBNA-1) IgG класса появляются как минимум лишь спустя 8-10 недель от начала заболевания. Таким образом, при наличии антител к EBNA-1 с высокой достоверностью можно исключить острую первичную инфекцию. Антитела к EBNA-2 появляются раньше, однако обычно позднее антител против VCA и EA антигенов. Если EBNA-1 полоска на блоте выражена сильнее EBNA-2 полоски, это указывает на позднюю стадию заболевания (2 года от начала первичного инфицирования). Клиническая значимость определения IgM антител к EBNA до настоящего времени не установлена.

Резюме интерпретации теста

Стадия заболевания

VCA

EA (R/D)

EBNA 1

EBNA 2

Первичная инфекция

+

+

-

+/-

Здоровые лица, перенесшие инфекцию в прошлом (6-8 недель после острой инфекции)

+

+/-

-

+

Здоровые лица, перенесшие инфекцию в прошлом (3 месяца после острой инфекции)

+

-

+

+/-

Реактивация инфекции - Обострение заболевания

+

+

+

+/-

Хроническая активная инфекция вирусом Эбштейн-Барр

IgA +

IgA +

(EA-D)

 

Злокачественные новообразования

IgG +++

+ (D и R)

 

 

Интерпретация

Первичная инфекция

VCA-IgM/ IgA положительны

Ранняя стадия инфекции, обычно 1 -3 недели от начала заболевания

VCA-IgG положительны

Ранняя стадия инфекции, могут сохраняться положительными в течение всей жизни

EA-D-IgG положительны

3 – 6 недели от начала заболевания

EA-R IgG положительны

3 – 6 месяцев от начала заболевания

EBNA-2 IgG положительны

6 – 12 месяцев от начала заболевания

EBNA-1 IgG положительны

Если данная полоска на блоте выражена сильнее полоски EBNA-2, это указывает на наличие поздней стадии заболевания (более 2 лет от начала заболевания)

Хроническая активная инфекция вирусом Эбштейн-Барр

VCA IgA положительны

EA-D IgA в ряде случаев могут быть положительны

Злокачественные образования

VCA IgG очень сильно положительны

EA-D и EA-R положительны

Ограниченности метода

·      Данная интерпретация теста касается только случаев классической первичной инфекции и реактивации инфекции. Особые формы инфекции, такие как хроническая активная инфекция вирусом Эбштейн-Барр, лимфома Burkitt или назофарингеальная карцинома могут иметь другие типы проявляющихся полосок на стрипе.

·  Отрицательные результаты не исключают возможности перенесенной инфекции. При наличии клинических данных рекомендуется проведение IgM теста. Если результаты обеих тестов отрицательны, необходимо повторить тест через 6-8 дней для исключения замедленного иммунологического ответа.

 

Обратная связь

E-mail: postmaster@westernblot.ru

Вы можете сделать данные тесты www.fides-lab.ru

Тел: 8 (495) 401 05 77

Москва, Алтуфьевское шоссе 9 (Метро Владыкино)