Вестернблоты - Иммуноблоты                         

 

инструкция по применению вестерблота
 

Инструкция по применению теста

 Требуемые материалы для проведения теста (не поставляемые вместе с набором)

·        одноразовые наконечники для пипеток с объемом  10, 20 и 1000 мкл

·        стандартный набор лабораторных стеклянных изделий

·        свежедистиллированная вода

·        вортэкс (Whirlmix)

·        одноразовые стеклянные или пластмассовые пробирки для разведения проб сыворотки крови

·        абсорбирующие бумажные полотенца

·        шэйкер

·        пинцеты   

Требования к пробам сыворотки пациента

Свежесобранная сыворотка крови, предназначенная для тестирования должна храниться при температуре 2 – 8 °C до проведения тестирования.

Если предполагается длительное (более 48 часов) хранение проб сыворотки, они должны быть заморожены и храниться при температуре –20 °C, или иметь консервант - 0,1 % натрия азид (sodium azide).

Загрязненная, гемолизированная или липемическая сыворотка может дать неправильные результаты.

Инактивация теплом при 56 °C не должно влиять на точность результата.

 

Iинструкции по приготовлению реагентов и их хранению

Все запечатанные компоненты теста должны использоваться до окончания срока годности, нанесенного на упаковку при условии хранения набора при температуре  2  8 °C.

Мембраны должны храниться при комнатной температуре после первого открытия упаковки.

Приготовление буфера для разведения пробы сыворотки крови (SDW)

Добавьте 20 мл концентрированного буфера к 180 мл дистиллированной воды (= 200 мл) и хорошо перемешайте полученный раствор. Раствор пригоден для употребления в течение 2 недель при хранении при температуре 2 – 8 °C.

Для проведения анализа 1 вестерноблота разведите 2 мл концентрированного буфера в 18 мл дистиллированной воды, 2 вестрнблотов - разведите 4 мл концентрированного буфера в 36 мл дистиллированной воды

Коньюгат

Во время проведения первой инкубации пробы сыворотки крови, разведите коньюгат:

 

Необходимое количество мембран

Буфер для разведения сыворовки и промывки мембран (миллилитров)

Концентрированный коньюгат (микролитров)

1

1,0

10

2

2,0

20

3

3,0

30

4

4,0

40

и т. д.

и т. Л.

и т. д.

Нет необходимости доводить коньюгат до комнатной температуры перед разведением. Рекомендуется достать коньюгат из холодильника, взять пипеткой  необходимое количество из упаковки и немедленно поставить коньюгат обратно в холодильник. После разведения коньюгат стабилен для применения в течение 1 часа при комнатной температуре (22 °C).

 Порядок проведения теста вестернблот

bullet Достаньте с помощью пинцета необходимое количество полосок блота из пробирки и поместите их в соответствующие ячейки инкубатора таким образом, чтобы  можно было видеть номер, написанный на полоске. Эта поверхность полоски в течение всего периода инкубации должна смотреть вверх. Если полоска при добавлении реагента в ячейку инкубатора перевернется в неправильное положение (номером вниз), немедленно переверните полоску в правильное положение (номером вверх).
bullet Добавьте 2 мл блокирующего буфера (хорошо перемешайте его перед использованием) к каждой полоске блота в соответствующую ячейку инкубатора. Обратите внимание на то, чтобы все полоски были полностью покрыты жидкостью. Это также очень важно для всех последующих этапов проведения теста. Инкубируйте полоски (мембраны) 15 минут на шэйкере при комнатной температуре. Жидкость должна хорошо перемешиваться в ячейках инкубатора, но ни в коем случае не должна переливаться в соседние ячейки. Это особенно важно для инкубирования полосок с сывороткой пациентов.
bullet Во время инкубирования полосок блота с блокирующим буфером разведите промывающий (он же разводяший) SDW буфер
bullet Приготовление буфера для разведения пробы сыворотки крови (SDW) Добавьте 20 мл концентрированного буфера к 180 мл дистиллированной воды (= 200 мл) и хорошо перемешайте полученный раствор. Раствор пригоден для употребления в течение 2 недель при хранении при температуре 2 – 8 °C. При проведении анализа 1 вестерноблота разведите 2 мл концентрированного буфера в 18 мл дистиллированной воды, при проведении 2 анализов вестернблотов - разведите 4 мл концентрированного буфера в 36 мл дистиллированной воды и т.д.
bullet Разведите пробы сыворотки пациентов в соотношении 1 : 51 с разведенным ранее (см. выше) SDW буфером - добавьте 20 мкл пробы сыворотки к 1000 мкл SDW буфера и тщательно перемешайте.
bullet Удалите блокирующий буфер, вылив его из инкубатора. К этому времени полоски блота (мембраны) будут полностью пропитаны жидкостью и будут прилипать к дну ячеек инкубатора во время слива жидкости (блокирующего буфера). Промывать мембраны вестернблота на данном этапе не нужно.
bullet Добавьте 1 мл разведенной сыворотки пациента к соответствующим полоскам блота (мембранам) и инкубируйте 40 минут на шэйкере при комнатной температуре.
bullet Удалите пробы разведенной сыворотки пациентов из ячеек инкубатора методом отсасывания. Тщательно промойте полоски блота 4 раза. Тщательная промывка – залог правильной постановки теста!!!
  1. Наклоните инкубатор и слейте жидкость, а остаток жидкости удалите из всех ячеек инкубатора методом аспирации.
  2. Следите за тем, что содержимое из одной ячейки не попало в другую ячейку.
  3. Добавьте 1 мл SDW буфера, поставьте на шэйкер на несколько секунд, затем удалите буфер методом аспирации.
  4. Добавьте 2 мл SDW буфера, поставьте на шэйкер на 3 минуты, затем удалите буфер методом аспирации. Повторите этот этап 2 раза.
  5. Переверните инкубатор и постучите на фильтровальную бумагу до тех пор, пока на ней не будет оставаться следов жидкости.

·        Во время проведения инкубации пробы сыворотки крови разведите коньюгат:

 

Необходимое количество мембран

Буфер для разведения сыворовки и промывки мембран (миллилитров)

Концентрированный коньюгат (микролитров)

1

1,0

10

2

2,0

20

3

3,0

30

4

4,0

40

и т. д.

и т. Л.

и т. д.

Нет необходимости доводить коньюгат до комнатной температуры перед разведением. Рекомендуется достать коньюгат из холодильника, взять пипеткой  необходимое количество из упаковки и немедленно поставить коньюгат обратно в холодильник. После разведения коньюгат стабилен для применения в течение 1 часа при комнатной температуре (22 °C).

bullet Добавьте 1 мл свежеприготовленного разведенного коньюгата в каждую ячейку инкубатора (к каждой полоске блота). Инкубируйте 30 минут на шэйкере при комнатной температуре.
bullet Промойте все полоски блота (мембраны) 4 раза как было описано ранее.
bullet Промойте все ячейки инкубатора (полоски) дистиллированной водой. Эта дополнительная промывка улучшит проявление полосок и уменьшит фоновую окраску.
bullet Добавьте 1 мл субстрата в каждую ячейку инкубатора (к каждой полоске блота). Инкубируйте 10 – 15 минут на шэйкере при комнатной температуре.
bullet Добавьте 1 мл стоп-раствора в каждую ячейку инкубатора (не удаляя субстрат) (к каждой полоске блота), осторожно встряхните в течение нескольких секунд и слейте жидкость из ячеек инкубатора. Добавьте снова 1 мл стоп-раствора в каждую ячейку инкубатора (к каждой полоске блота), поставьте на инкубатор на 3 минуты, а затем слейте жидкость из ячеек инкубатора.
bullet Выньте полоски блота (мембраны) из ячеек инкубатора с помощью пинцета и просушите их на фильтровальной бумаге. Анализируйте расположение появившихся полосок на мембране в соответствии с протоколом, предлагаемом на следующей странице. Для документации храните полоски блота (мембраны) в защищенном от света месте.

 

общий алгоритм проведения теста Вестернблота

Поместите мембрану блота в ячейку инкубатора и добавьте 2 мл блокирующего буфера

Инкубируйте 15 минут на шэйкере при комнатной температуре, а затем удалите блокирующий  буфер.

Не промывайте мембраны блота

Во время первой инкубации разведите промывающий (он же разводящий) SDW буфер в соотношении 1:10 дистиллированной водой (20 мл конц. SDW буфера – 180 мл дист.воды)

Разведите пробы сыворотки в соотношении 1 : 51 разведенным SDW буфером – тщательно перемешайте

добавьте 1 мл разведенной пробы сыворотки к каждой мембране блота – в каждую ячейку инкубатора

инкубируйте 40 минут на шэйкере при комнатной температуре

В это время разведите коньюгат разведенным ранее SDW буфером в соотношении 1:100

промойте мембраны 4 раза

добавьте 1 мл свежеприготовленного разведенного (1:100) коньюгата  к каждой мембране блота – в каждую ячейку инкубатора

 

инкубируйте 30 минут на шэйкере при комнатной температуре

промойте мембраны 4 раза

добавьте 1 мл субстрата к каждой мембране блота - в каждую ячейку инкубатора

инкубируйте 10 - 15 минут минут на шэйкере при комнатной температуре

добавьте 1 мл стоп-раствора к каждой мембране блота - в каждую ячейку инкубатора

инкубируйте 3 минуты на шэйкере при комнатной температуре

Анализируйте тип проявившихся на мембране поперечных полосок с помощью специального шаблона или программы Westernblot Scanner

...

Обратная связь

E-mail: postmaster@westernblot.ru

Вы можете сделать данные тесты www.fides-lab.ru

Тел: 8 (495) 401 05 77

Москва, Алтуфьевское шоссе 9 (Метро Владыкино)